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///导读颅内细菌性脓肿是危及生命的感染，需要手术引流和长期的抗生素治疗。目前该病尽管在诊断和治疗方面都有所改善，但相关患者仍具有高死亡率和严重的后遗症。脑脓肿通常为混合菌群感染造成的，包括一些需氧和厌氧微生物，这些微生物往往很难培养。而16SrDNA扩增子测序技术可用于样本中细菌的检测，同时成本较低，非常适合于细菌性脑脓肿病原体的诊断。因此，医院临床微生物学、免疫学和卫生研究所团队，收集了来自54例颅内脓肿或脑膜炎患者的79份样本，利用IlluminaMiSeq平台进行16SrDNA扩增子测序分析，并将检测结果与革兰氏染色、培养和Sanger测序结果进行比较。结果显16SrDNA扩增子测序分析成功检出了51例颅内脓肿(46例脑脓肿，5例硬膜外脓肿)和9例脑膜炎病例的病原体。16SrDNA扩增子测序分析共鉴定出86种脑脓肿细菌，其中中间链球菌（Streptococcusintermedius）和具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum）最为普遍，此外，丙酸杆菌和葡萄球菌与硬膜外脓肿有关。16SrDNA扩增子测序分析在31/51个颅内脓肿中发现了两个或两个以上的细菌分类群，揭示了脓肿感染的多微生物性质，每个样本可以鉴别多达16个细菌分类群。以上结果表明16SrDNA扩增子测序分析扩大了脑脓肿中检测到的细菌谱，并证明MiSeq平台适用于这种严重感染的诊断。文献ID▼英文题目：Moleculardiagnosisofpolymicrobialbrainabscesseswith16S-rDNA-basednext-generationsequencing中文题目：基于16SrDNA的下一代测序对多种微生物感染脑脓肿的分子诊断发表期刊：ClinMicrobiolInfect见刊时间：.03.31IF：7.发表单位：医院临床微生物学、免疫学和卫生研究所材料与方法▼该研究医院微生物研究所7年期间（年至年）收集的来自54例颅内脓肿或脑膜炎患者的79份样本，包括来自40例颅内脓肿患者的62份样本，以及来自14例细菌性脑膜炎患者的17份脑脊液样本（作为单细菌感染样本）。颅内脓肿患者的平均年龄为49±20.4岁(范围5-89)；其中女性12例，男性28例。脑膜炎患者53±21.4岁(1-78)，其中女性6例，男性8例。通过回顾临床资料，检索诊断为脑脓肿和脑膜炎患者的临床资料，为28例颅内脓肿和8例脑膜炎患者提供了可靠的信息。大多数样本医院神经外科进行微生物诊断。另外，采集一份人支原体检测呈阳性的呼吸道样本和一份发酵支原体污染的细胞培养样本进行支原体DNA检测。样本通过神经外科引流、脓肿清除收集或在有脑膜炎症状的情况下，通过腰椎穿刺获得脑脊液。随后进行革兰氏染色和显微镜观察、培养、常规Sanger测序以及16SrDNAV3/V4区扩增子测序分析。研究成果▼1.MiSeq样品处理流程的效率从54例脑脓肿、硬膜外脓肿或细菌性脑膜炎患者中收集的79份样本中提取DNA，采用V3/V4引物扩增16SrDNA，并进行建库。其中有64份样本，通过文库质检，进行MiSeq上机测序（图1(C)）。其中两个脑脓肿样本，下机后reads数很少或没有(52和0reads)，下机后共获得60份样本的合格数据（包括51例颅内脓肿和9例脑膜炎样本），合格样本reads数分布较广(范围为-)，但与阴性样本明显分离。因此，MiSeq方案成功分析了60/79个DNA样本（图1(D)）。总共从60个样本中获得了,Reads，平均每个样本Reads数为20,。图1.MiSeqNGS分析的样品处理流程2.设置阈值区分真阳性和污染细菌该研究使用细菌性脑膜炎样本（单细菌感染）测序结果作为参考，评估16SrDNA测序流程的背景污染情况。在7个由经典病原体脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌或流感嗜血杆菌引起的脑膜炎样本中，超过99.5%的Reads与致病细菌匹配。1例肺炎链球菌感染患者的脑脊液样本共包含条非肺炎链球菌的Reads。其中，痤疮丙酸杆菌36条Reads，占0.4%；罗得西亚假单胞菌41条Reads,占0.4%；根癌农杆菌16条Reads，占0.2%。由于这些物种在这个脑膜炎病例中被认为是污染物，因此，研究人员设立50条Reads或Reads数占比1%作为cut-off值用于感染病原体的判断。MiSeq分析了另一份来自猫咬后培养阴性细菌性脑膜炎患者的脑脊液样本（同时用16S扩增子Sanger测序结果证实），结果检测到猫咬后最常见的多杀性巴斯德杆菌(47.4%reads)；此外，还检测到胸膜肺炎放线杆菌(45.6%)、心绞痛链球菌(1.7%)和中间链球菌(1.7%)，表明了该脑膜炎病例多种微生物感染的特性。3.MiSeq测序分析在脑脓肿样本中检测到的细菌种类谱该研究使用1%的Reads数占比作为判别污染序列的阈值，以防止脑脓肿样本检测结果的假阳性。但是，当一个多微生物样品中因为某一物种具有绝对优势的Reads数占比时，相对占比较小的细菌分类群就会被丢弃，这样一个严格的阈值可能会产生假阴性。例如，有一个脑脓肿样本为Trueperellabernardiae培养阳性，其中NGS检测到T.bernardiae有69条Reads数，仅占所有Reads的0.17%。因此，研究人员同时选择了50条Reads作为判断标准，以避免假阴性结果。采用1%或50条Reads的临界值，在种或属水平上共检测到86个不同的细菌类群（表1）。通过MiSeq分析，在脑脓肿样本中最常见的类群是具核梭杆菌和中间链球菌，51例颅内脓肿标本中分别检出27例和26例。再加上普雷沃氏菌(普雷沃氏菌是第二常见的细菌种类)，它们占了所有序列reads的55%。表1.颅内脓肿标本中细菌种类总结
由于MiSeq检测结果中均没有支原体16SrDNA的reads，研究人员进一步探究该方法能否检测到支原体序列。首先，已证实了V3/V4扩增子引物与多个支原体的序列匹配，随后，分析了一份之前检测人支原体阳性的呼吸样本和一份含有发酵支原体的细胞培养样本。两份样本的MiSeq结果均检测到大量的支原体DNA序列，表明脑脓肿样本中未检测到支原体DNA的情况是非技术原因。4.MiSeq测序分析确定了脑脓肿宏基因组的成员将上述的判定标准应用于所有颅内脓肿和脑膜炎样本的MiSeq数据，结果发现，正如预期，9个脑膜炎样本中有8个只包含一个重要的细菌物种，而51个颅内脓肿样本(脑和硬膜外)中有31个由至少由两种(多达16种)不同的细菌组成(图2)。因此，MiSeq方法显示大多数颅内脓肿是多微生物感染导致的。图2.脑膜炎与颅内脓肿样本中的细菌分类群数量
12/46份脑脓肿样本经经典微生物学检测（培养）结果为阴性，很可能是由于手术引流脓肿前开始抗生素治疗所致(图3(A))。在27/46个样本中，通过培养鉴定的细菌类群数量低于MiSeq，但在一小部分样本(4/46)中，情况正好相反(图3(B))。16SrDNA扩增子的常规Sanger测序在27/44个脑脓肿样本中得到单一的特定序列，在17/44个样本中显示多微生物模式(图3(C))，在给定样本中通过Sanger测序确定的所有细菌类群也在MiSeq数据集中被发现。相比之下，MiSeq在将近一半的样本中鉴定出了其他细菌分类群(图3(D))。因此，对脑脓肿样本的MiSeq分析提高了脑脓肿样本中细菌的检出率，并能够区分感染部位多种微生物的混合感染。图3.脑脓肿标本培养、16SrDNAPCR产物常规Sanger测序和MiSeqNGS测序比较5.细菌谱与推测的颅内脓肿病灶的相关性研究人员回顾了颅内脓肿患者的临床病史，以分析感染源。只有17例患者(对应26个样本)可以从病历中确定或推测感染来源(图4(a))。鼻/口咽疾病是最常见的感染来源(6例患者有不良的牙齿状况，1例为牙龈癌，2例为鼻窦炎)，其次是4例患者术后发展为硬膜外脓肿。这两种情况检测到的细菌谱与其他情况的差异最大。其中，术后标本以皮肤共生菌(葡萄球菌、丙酸杆菌、链球菌)为主。此外，脑脓肿中有更多样的鼻/口咽部细菌(链球菌，厌氧菌)(图4(B))。图4.脑脓肿样本的感染源和细菌谱
研究结论▼通过16SrDNA扩增子测序分析，发现在脓肿样本中包含86个不同的细菌类群。与培养或Sanger测序结果相比，揭示了更为复杂的细菌组成。此外，该研究鉴定到的细菌谱范围从口咽细菌(如梭菌属、中间链球菌、微小单胞菌、牙龈卟啉单胞菌)到皮肤共生菌(痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌)，也包括一些不常见的与脑脓肿相关的病原体，如牙密螺旋体、Trueperellabernardiae和害肺小杆菌。因此，基于16SrDNA扩增子测序分析发现的细菌谱，能够为脑脓肿患者的治疗提供比较全面的病原学依据。此外，基于16SrDNA扩增子测序分析发现脑脓肿更广泛的细菌分类群，特别是厌氧菌，表明依赖培养或Sanger测序结果将导致一些脑脓肿患者治疗不足。大规模的平行测序可能导致在样本处理过程中出现交叉污染，以及测序过程中的聚类错误分配和指数跳变，使得有时很难区分污染和真实信号。双index测序将技术相关的错误率降低到0.5%以下，尽管仍有可提升的空间。为了解决影响分析的已知问题，该研究没有在PCR反应中加入真阴性对照样本。而是使用单细菌脑膜炎样本来控制背景污染，并建立一个cut-off值，即Reads占比1%。对于一些经培养鉴定的细菌分类样本，Reads占比1%，因此额外选择了50条reads的判定标准。这种组合判定标准(1%OR50reads)最大限度地减少了误报和漏报，但也不能保证在所有情况下完全区分真实信号和污染物。由于16SrDNA扩增子测序分析的局限性，当V3/V4引物产生的16SrDNA片段在相近物种中高度相似或相同时，无法在种水平上进行细菌分类。例如肺炎链球菌和其他支气管炎链球菌群成员的情况即是如此。为了提高物种的鉴定水平，已有研究报道利用MiSeq平台成功检测了16SrDNA基因的全长序列。此外，还可以从公开的16SrDNA数据库或已发表的文献中选择物种特异性PCR引物，在种水平上阐明细菌的特性。综上，与传统方法相比，16SrDNA扩增子测序分析能够在脑脓肿样本中鉴定到更多的细菌种类。补充16SrDNA扩增子测序分析能够增强诊断能力，将使更有针对性且全面的抗生素治疗成为可能，从而在符合抗生素管理目标的同时使患者个人受益。与传统的Sanger测序相比，16SrDNA扩增子测序分析工作流程需要大约2天的时间才能完成。然而，考虑到颅内感染的严重程度和抗生素治疗时间的延长，将16SrDNA扩增子测序分析应用于脑脓肿患者的价值值得进一步研究。研究亮点▼本研究评估了16SrDNA扩增子测序分析在脑脓肿或细菌性脑膜炎患者中的应用价值原文链接：